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      周斌組合作揭示動脈穩態和疾病中內皮細胞增殖情況及調控機制

      文章來源:分子細胞科學卓越創新中心  |  發布時間:2023-12-18  |  【打印】 【關閉

        

        12月12日,國際學術期刊Circulation在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)周斌研究組與上海市胸科醫院何奔研究組的最新合作研究成果“Dynamics of Endothelial Cell Generation and Turnover in Arteries during Homeostasis and Diseases”。該項工作利用雙同源重組系統構建一種可以長時程不間斷捕捉體內內皮細胞增殖的技術,揭示了在穩態、高血壓和糖尿病狀態下主動脈內皮細胞的增殖情況。

        內皮細胞是心血管疾病基礎研究中最重要的細胞之一,其完整性在心血管系統功能維持中發揮著重要作用。內皮細胞損傷和丟失與多種心血管疾病的發生發展有著密切關系,如高血壓和糖尿病及其并發癥。內皮細胞增殖或內皮祖細胞的分化是損傷血管新生內皮的主要來源。最早有研究發現在人外周血中存在內皮祖細胞,經過分離得到的內皮祖細胞在體外可以分化成內皮細胞且移植后可以參與新生血管形成。而后有多項研究利用骨髓移植或異體共生的方法,并沒有在小鼠體內尋找到骨髓或外周血來源的內皮祖細胞。近期的一項研究也進一步否定了人體骨髓細胞中存在內皮祖細胞,提示新生血管內皮應是來自組織原有的內皮細胞增殖。最近的譜系追蹤研究表明,損傷后的血管修復和再生是由內皮細胞增殖而來的,且其增殖能力存在異質性。依據體外克隆形成實驗和譜系追蹤,發現存在一些內皮亞群具有更高的增殖能力,如side population、Procr+、c-kit+、Sca1+的內皮細胞。但是這些研究大多從分子標志出發,而后驗證表達這些標志的細胞都具有內皮祖細胞的特性,這也導致了不同研究提出的內皮祖細胞標志不同,這些細胞是否是同一細胞類群也不清楚。另外,大血管如主動脈的內皮細胞增殖率低,同時缺少可靠的細胞增殖記錄方式,導致難以開展尋找主動脈中高增殖內皮亞群的研究。同時內皮細胞增殖率受體內復雜環境和血流模式的影響,在高血壓、糖尿病等疾病狀態下如何變化尚不清楚?;诖?,何奔教授團隊從研發高效標記內皮細胞增殖的譜系追蹤方法出發,以尋求在維持血管穩態和疾病中的關鍵靶點。

        Ki67是細胞周期標記物,可以用于評估組織中發生增殖的細胞。然而Ki67是瞬時表達在正在發生增殖事件的細胞,故Ki67報告示蹤鼠可以用于追蹤特定時間點增殖的細胞,但對于主動脈內皮這種低增殖率的細胞檢出效果較差?;谥暗难芯?,Dre-rox與Cre-loxP兩種重組酶系統可以在細胞內互不干擾共同發揮作用。研究團隊在此基礎上,構建了Ki67-Cre-rox-ER-roxKi67-CrexER),經Dre重組酶剪切后變成Ki67-Cre,從而實現長時程標記Dre重組之后發生增殖行為的細胞。首先他們構建了R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP (ProTracer)示蹤鼠,實現標記他莫昔芬誘導后所有發生增殖的細胞。與傳統的Ki67-CrexER;R26-GFP示蹤鼠以及EdU摻入相比,ProTracer鼠在主動脈內皮這種低增殖率的細胞具有更高的檢出效率,每個月約有3%的內皮細胞發生增殖。

        為了特異性檢測內皮細胞的增殖,研究團隊構建了Cdh5-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP(EC-ProTracer)示蹤鼠,實現特異性標記增殖的內皮細胞。與ProTracer鼠結果一致,隨著時間的延長,發生增殖的內皮細胞越多。從熒光結果可以看出,增殖行為多為一分二的方式,同時會將兩個相鄰的細胞進行標記,作者定義了這種相鄰兩個細胞增殖方向與血流方向的關系,角度小于±30°定義為平行血流方向增殖,反之為垂直血流方向增殖。有趣的結果發現,這種增殖行為在主動脈內皮多為平行血流方向,在下腔靜脈內皮則多為垂直血流方向。

        先前的研究已表明,血流剪切力感應器Piezo1參與調節內皮細胞重組以及脈管系統發育成熟。那Piezo1是否參與調節血管內皮增殖及增殖方向呢?作者在ProTracer示蹤鼠的基礎上構建了Piezo1敲除小鼠,發現其主要與主動脈內皮增殖方向有關,與增殖能力及靜脈內皮的增殖無關。

        如前所述,內皮細胞存在異質性,增殖能力有差別,本研究的熒光結果也表明內皮細胞增殖能力存在差異。單細胞轉錄組測序可以有效區分這些存在差異的細胞亞群。作者將穩態條件下誘導標記八周的ProTracer鼠進行單細胞轉錄組測序,將內皮細胞提取出來進行亞群分析?;谑欠癖磉_GFP,可以將細胞分為發生增殖事件的細胞和未增殖的細胞。結果發現EC-1亞群(較為特異性表達Ly6C的亞群)具有更強的細胞增殖能力,擬時序分析也發現這群細胞分化程度更低,同時表達干細胞的標記物如Sca1、Sox18等。這些結果表明Ly6C+ EC-1亞群具有內皮祖細胞的特征。

        為了探究影響內皮細胞增殖的分子機制,作者發現VEGFR2(基因名Kdr)在EC-1中具有顯著的表達。也有文章報道Yap1參與內皮細胞對機械壓力的反應從而引起內皮細胞的炎癥,但其是否能調節內皮細胞增殖仍不清楚。故作者在ProTracer鼠基礎上構建了基因敲除Kdr或Yap1,發現分別敲除Kdr和Yap1之后,主動脈和靜脈的內皮增殖信號均顯著降低,且在Yap1敲除后Kdr的表達水平也顯著降低,提示Yap1可能部分通過Kdr影響內皮細胞的增殖,即Hippo/VEGFR2通路調控大血管內皮細胞的增殖。

        為了探究主動脈內皮細胞在疾病中的變化情況,作者在示蹤鼠的基礎檢測了高血壓與糖尿病模型中內皮細胞的增殖情況。有趣的結果發現,在這兩種慢性病中,內皮細胞增殖在高血壓組增加,而在2型糖尿?。═2D)組減少。在T2D中,盡管內皮增殖程度是降低的,但是EC-1細胞的增殖能力仍然高于其他內皮,如何恢復這群細胞的增殖分化能力可作為干預2型糖尿病血管損傷靶標。以上研究揭示了穩態和高血壓、糖尿病狀態下大血管內皮細胞增殖的異質性,尋找到一群具有高增殖潛能的內皮細胞亞群,并探討了影響其增殖的分子機制,為以后預防高血壓、糖尿病的血管病變提供新思路。

        上海市胸科醫院博士后李逸,分子細胞卓越中心博士研究生劉子鑫,上海市胸科醫院博士后韓溪檬和博士研究生梁楓為該論文共同第一作者。上海市胸科醫院何奔教授和分子細胞卓越中心周斌研究員為該論文共同通訊作者。該項工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國科學院、上海市及新基石科學基金等項目資助。

        文章鏈接:https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064301

      傳統Ki67示蹤和ProTracer示蹤細胞增殖效率對比

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